來源：本站 作者：jiyuanbio 時間：2025/5/23

數(shù)字PCR在食品研究中的應(yīng)用

數(shù)字PCR（dPCR）作為一種高靈敏度、高特異性的分子檢測技術(shù)，近年來在食品研究領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。它能夠精確量化食品中微量目標(biāo)DNA，快速識別和定量食品中的致病菌、轉(zhuǎn)基因成分及其他重要指標(biāo)。通過數(shù)字PCR，研究人員不僅可以提高檢測的準(zhǔn)確性，還能縮短檢測時間，為食品安全監(jiān)測和質(zhì)量控制提供有力支持。在本期文章中，我們將深入探討數(shù)字PCR在食品研究中的具體應(yīng)用案例，以及它如何推動食品安全和質(zhì)量的提升。

數(shù)字PCR原理

數(shù)字PCR（dPCR）是一種基于PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)的定量分析方法，其原理是將待擴增的DNA樣本分配到大量微小反應(yīng)室中，每個反應(yīng)室中可能含有零個或一個目標(biāo)DNA分子。通過進(jìn)行PCR擴增，只有含有目標(biāo)DNA的反應(yīng)室會產(chǎn)生熒光信號。最終，通過統(tǒng)計陽性反應(yīng)室的數(shù)量，利用泊松分布公式，可以精確計算出樣本中目標(biāo)DNA的絕對拷貝數(shù)。這種方法具有高靈敏度和高特異性，能夠有效克服傳統(tǒng)PCR在定量分析中的局限性。

數(shù)字PCR與食品研究

數(shù)字PCR在食品研究領(lǐng)域的應(yīng)用眾多，以下選取幾個常用的應(yīng)用展開討論。

轉(zhuǎn)基因食品檢測

我國非常重視轉(zhuǎn)基因食品安全問題，已建立了一套嚴(yán)格規(guī)范的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價和監(jiān)管制度。我國對轉(zhuǎn)基因食品實行按目錄定性強制標(biāo)識制度。

    2023年10月17日《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于修改農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法的決定（征求意見稿）》，其中，一項新規(guī)定引起關(guān)注，即“單一作物轉(zhuǎn)基因成分含量超過產(chǎn)品3%時應(yīng)當(dāng)標(biāo)識”。根據(jù)意見稿這一規(guī)定，我國轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識或?qū)⒂?/span>“定性標(biāo)識”改為“定量標(biāo)識”，并設(shè)置3%的閾值。

    隨著轉(zhuǎn)基因生物使用的增加，含有轉(zhuǎn)基因生物的基質(zhì)也變得越來越復(fù)雜。最常見的基于DNA的轉(zhuǎn)基因生物檢測和定量方法是實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)。然而，由于qPCR對抑制劑敏感，且定量依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，在復(fù)雜基質(zhì)的轉(zhuǎn)基因生物定量中應(yīng)用有限。

為了克服這一障礙，研究者們[1]提出了針對“抗農(nóng)達(dá)”大豆和大豆內(nèi)參基因的液滴數(shù)字PCR (ddPCR)檢測方法。對四個真實樣本的適用性研究和基于室的PCR系統(tǒng)的使用表明，dPCR在改進(jìn)轉(zhuǎn)基因生物檢測和食品真實性監(jiān)測方面具有巨大的潛力。

dPCR定量，抗抑制，無需標(biāo)準(zhǔn)品，靈敏度高

食品中病原體鑒定

病毒

乙型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）作為引起人類急性病毒性肝炎的重要原因，通過受污染食品的傳播在工業(yè)化國家中尤為突出。傳統(tǒng)的實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）技術(shù)雖在病毒檢測中發(fā)揮著重要作用，但在食品樣品中病毒濃度低和抑制物質(zhì)存在的情況下，其定量能力受限。

    研究人員[2]開發(fā)了一種基于ddPCR技術(shù)的雙重檢測方法，用于食品中HEV的定量檢測，檢測限（LOD）達(dá)到0.34 copies/μL。

同時，研究團(tuán)隊將新開發(fā)的ddPCR方法應(yīng)用于自然污染的野豬肉樣本分析。結(jié)果顯示ddPCR方法能夠準(zhǔn)確確認(rèn)樣本的陽性和陰性狀態(tài)，并且在病毒滴度較低的樣本中，ddPCR提供了更精確的定量結(jié)果。這表明ddPCR技術(shù)在檢測食品中低濃度HEV RNA方面具有明顯優(yōu)勢。

數(shù)字PCR技術(shù)以其無需標(biāo)準(zhǔn)曲線、精確定量的優(yōu)勢，為食品中病毒的檢測和定量提供了新的解決方案。ddPCR技術(shù)通過將樣品稀釋并分配到成千上萬的小滴中，每個小滴獨立進(jìn)行PCR擴增，從而實現(xiàn)對目標(biāo)DNA分子的絕對定量。與傳統(tǒng)的RT-qPCR相比，ddPCR不受擴增效率的影響，減少了食品樣品中抑制物質(zhì)對病毒定量的干擾，提供了更高的精確度和靈敏度。

細(xì)菌

在食品安全領(lǐng)域，準(zhǔn)確檢測食品中的病原體是保障消費者健康的關(guān)鍵。然而，傳統(tǒng)的檢測方法往往存在局限性，特別是在面對病原體處于可存活但不可培養(yǎng)（Viable but Non-Culturable, VBNC）狀態(tài)時。近期，一項發(fā)表在《OncoTargets and Therapy》上的研究[3]，利用數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）技術(shù)，對面粉中沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）的VBNC狀態(tài)進(jìn)行了定量檢測和生存分析，為食品安全檢測提供了新的技術(shù)手段。

沙門氏菌是一種常見的食源性病原體，可導(dǎo)致嚴(yán)重的食品安全問題。在VBNC（可存活但不可培養(yǎng)）狀態(tài)下，細(xì)菌雖然代謝活躍，但無法通過常規(guī)的培養(yǎng)方法檢測，這給食品安全檢測帶來了巨大挑戰(zhàn)。

使用ddPCR，對面粉樣本中的沙門氏菌進(jìn)行了定量檢測。實驗結(jié)果表明ddPCR 技術(shù)能夠有效區(qū)分VBNC狀態(tài)的沙門氏菌，并準(zhǔn)確評估其在不同環(huán)境條件下的生存狀態(tài)。

研究結(jié)果顯示，ddPCR技術(shù)在檢測VBNC狀態(tài)的沙門氏菌時，展現(xiàn)出了比qPCR更高的靈敏度（3copies/μL）和準(zhǔn)確性。在評估細(xì)胞活性方面，ddPCR與熒光顯微鏡的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了其在食品安全檢測中的潛力。

這項研究不僅證實了ddPCR技術(shù)在檢測VBNC狀態(tài)病原體中的有效性，也為食品安全檢測提供了新的策略。通過ddPCR技術(shù)，可以更準(zhǔn)確地評估食品中病原體的風(fēng)險，從而為消費者提供更安全的食源性產(chǎn)品。

食品中微生物鑒定

乳酸菌參與了肉、奶、魚、蔬菜等食品的自發(fā)發(fā)酵。它們是人類胃腸道的共生居民，對人類健康有貢獻(xiàn)。作為益生菌，乳酸菌已顯示出有益的作用，如預(yù)防腹瀉和炎癥性腸病。乳酸菌的定量對流行病學(xué)研究及其在各種利基市場中的作用具有重要意義。

研究者[4]評估了基于分子基因的ddPCR檢測方法在植物乳桿菌亞種檢測中的適用，將ddPCR的性能特征與定量實時PCR (qPCR)的性能特征進(jìn)行比較。結(jié)果表明：ddPCR技術(shù)展現(xiàn)出比qPCR更高的靈敏度，能夠檢測到更低濃度的乳酸菌。ddPCR技術(shù)不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠直接提供目標(biāo)DNA分子的絕對數(shù)量，且ddPCR在檢測限和定量限方面均優(yōu)于qPCR。

食品中過敏源鑒定

芝麻作為一種重要的過敏原，其在食品中的微量存在可能引發(fā)敏感個體的嚴(yán)重過敏反應(yīng)。因此，能夠準(zhǔn)確檢測食品中芝麻的存在變得尤為重要。然而，傳統(tǒng)的檢測方法在靈敏度和精確度上存在局限，難以滿足高標(biāo)準(zhǔn)的檢測需求。    

研究者們[5]開發(fā)了兩種ndPCR方法，針對芝麻的CO6b-1和ITS區(qū)域，實現(xiàn)了在面團(tuán)/餅干中5和0.1 mg/kg的芝麻檢測靈敏度。這一靈敏度比實時PCR提高了整整一個數(shù)量級，且不受食品加工過程的影響。    

結(jié)果顯示，無論是在原始面團(tuán)還是經(jīng)過烘焙處理的餅干中，ndPCR技術(shù)都能穩(wěn)定地檢測到目標(biāo)DNA，展現(xiàn)了出色的線性、精確度和靈敏度。    與傳統(tǒng)的實時PCR相比，ndPCR技術(shù)不受PCR抑制劑的影響，提供絕對定量，無需使用校準(zhǔn)曲線。這項技術(shù)通過將反應(yīng)液隨機高度分割成個體分區(qū)，根據(jù)熒光信號判斷分區(qū)是陽性還是陰性，從而計算目標(biāo)DNA的絕對數(shù)量。    

研究者還將ndPCR技術(shù)應(yīng)用于商業(yè)樣品的檢測，包括餅干、糕點、能量棒和香腸等，證明了該技術(shù)在實際食品檢測中的潛力。這些結(jié)果不僅為食品生產(chǎn)者提供了一種新的工具，也有助于保護(hù)過敏體質(zhì)消費者的飲食安全。    

隨著ndPCR技術(shù)的不斷發(fā)展，我們期待它能夠被應(yīng)用于更廣泛的過敏原食品檢測，包括樹堅果、花生、大豆、小麥、魚類、甲殼類動物、牛奶等。此外，ndPCR技術(shù)在多重檢測方面的潛力也值得進(jìn)一步探索，以實現(xiàn)對多種過敏原的同時檢測。

 

食品中品種鑒定

肉類

肉類產(chǎn)品的真實性和可追溯性是確保食品和錯誤標(biāo)簽(例如包括來自非申報物種的肉類)安全的首要問題。食品摻假(例如，在肉末中添加廉價的切塊)在世界范圍內(nèi)經(jīng)常發(fā)生。   

研究者[6]應(yīng)用ddPCR法對肉制品中的牛肉、豬肉、馬、羊、雞肉和火雞肉進(jìn)行檢測和定量(copy/uL)。對商品肉類進(jìn)行的分析顯示，除了公布的DNA外，還存在其他動物物種的DNA痕跡。詳見下表。

結(jié)果表明，該方法具有較高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度(準(zhǔn)確度100%)。主管食品安全部門可以采用該方法來驗證肉制品標(biāo)簽的符合性，并確保從初級生產(chǎn)到消費的整個肉類供應(yīng)鏈的質(zhì)量和安全。

農(nóng)作物

中國最常見的淀粉類型是馬鈴薯、紅薯、木薯、玉米和小麥。價格差異會導(dǎo)致淀粉摻假。木薯淀粉是較為昂貴的淀粉摻假的主要原料，因此需要靈敏的檢測技術(shù)來檢測和阻止摻假。淀粉的檢測主要包括感官檢測和理化檢測。然而，這些檢測方法耗時費力，無法測量摻假程度。

 研究者[7]采用液滴數(shù)字PCR (ddPCR)技術(shù)鑒定淀粉產(chǎn)品中的木薯摻假。分析表明，ddPCR方法檢測，木薯質(zhì)量(M)與木薯提取DNA含量呈顯著線性關(guān)系，DNA含量與DNA拷貝數(shù)(C)也呈線性關(guān)系，通過構(gòu)建的摻假模型驗證了該方法的準(zhǔn)確性和應(yīng)用潛力。

 結(jié)論：該方法可定量測定市售淀粉的摻假程度。ddPCR也可以應(yīng)用于廣泛的摻假檢測。

保健品

食品摻假往往導(dǎo)致消費者不信任和不公平的商業(yè)競爭。保健食品原料粉的交易形式容易摻假，因此，需要一種有效的粉末產(chǎn)品檢測和定性分析方法。

本研究[8]旨在建立、優(yōu)化和驗證一種基于液滴數(shù)字PCR (ddPCR)的三七主根粉的準(zhǔn)確鑒定和定量方法，為三七質(zhì)量控制提供依據(jù)。選取單拷貝核基因二?；视图っ?/span>1基因，設(shè)計三七特異性引物和探針。以DNA濃度為換算因子，建立了以DNA拷貝數(shù)為基礎(chǔ)確定三七粉質(zhì)量的方程。通過對已知三七散成分的混合粉末樣品進(jìn)行分析，驗證了ddPCR方法的準(zhǔn)確性。為了驗證該方法的適用性，同時對市售產(chǎn)品進(jìn)行了檢測。

該方法精密度高，適用于三七散的定性和定量分析。該方法可作為三七散質(zhì)量控制的有效工具。

 

 

參考文獻(xiàn)

[1] Kosir A B , Demsar T , Stebih D ,et al.Digital PCR as an effective tool for GMO quantification in complex matrices[J].Food Chemistry, 2019, 294(OCT.1):73-78.

[2] La Bella, Gianfranco, et al. "Duplex Droplet Digital PCR Assay for Quantification of Hepatitis E Virus in Food." Viruses 16.3 (2024): 413.

[3] Li, Liyan, and Sungwoo Bae. "Quantitative detection and survival analysis of VBNC Salmonella Typhimurium in flour using droplet digital PCR and DNA-intercalating dyes." Microbiology Spectrum 12.8 (2024): e00249-24.

[4] Choi, Chang-Hun, et al. "Comparison of Real-Time PCR and Droplet Digital PCR for the Quantitative Detection of Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum." Foods 11.9 (2022): 1331.

[5] Villa, Caterina, Joana Costa, and Isabel Mafra. "First nanoplate digital PCR method to trace allergenic foods: Improved sensitivity for the detection of sesame." Food Chemistry 444 (2024): 138650.

[6] Application of the novel Droplet digital PCR technology for identification of meat species[J].International Journal of Food Science & Technology, 2020, 55(3).

[7] Chen J , Zhang Y , Chen C ,et al.Identification and quantification of cassava starch adulteration in different food starches by droplet digital PCR[J].PLoS ONE, 2020, 15(2):e0228624.

[8] Yu, Ning, et al. "A novel analytical droplet digital PCR method for identification and quantification of raw health food material powder from Panax notoginseng." Food Analytical Methods 14 (2021): 552-560.