來源：本站 作者：zhangyang 時間：2025/2/20

數(shù)字PCR檢測如何環(huán)境DNA？不同原理的數(shù)字PCR有何區(qū)別？

檢測環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）極大地提高了對水生生物的檢測，特別是對稀有或瀕危物種的。通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），可以收集、提取和擴(kuò)增在正?；顒訒r從個體中脫落或排泄的eDNA，以揭示棲息地的物種組成。一些研究開始使用定量PCR（qPCR）來證明DNA估計與豐度或生物量之間的顯著相關(guān)性，但也會出現(xiàn)測不準(zhǔn)的情況。不僅如此植物致病菌的診斷也可以通過環(huán)境DNA提早檢測以提早預(yù)防，采用可靠的檢測方法對于在無害蟲地區(qū)建立或傳播之前確定害蟲的存在至關(guān)重要。下面通過兩篇文獻(xiàn)來了解數(shù)字PCR在環(huán)境DNA監(jiān)測中的應(yīng)用。

實驗背景

文章一：柑橘類細(xì)菌性潰瘍?。?/span>CBC），由柑橘黃單胞菌引起的植物疾病。為了在有癥狀或無癥狀的植物材料中及早檢測出這種病菌，需要對其進(jìn)行及時的檢測。在本研究中通過液滴式數(shù)字PCR與實時PCR進(jìn)行了檢測，比較兩種檢測方法的準(zhǔn)確度以及靈敏度。

文章二：由于繁殖的植物材料只在少數(shù)幾個大型苗圃中生產(chǎn)，然后分發(fā)給位于其他地區(qū)或國家的其他苗圃。這樣增加了感染疫霉的植物被引入新地區(qū)的風(fēng)險。目前尚無有效的手段來控制土源性疫霉菌病，分子診斷可以更準(zhǔn)確地鑒定物種，提高疫霉菌的檢測。在本研究中，我們評估了利用dPCR和qPCR在多個背景基質(zhì)中定量煙疫霉的可行性，包括宿主組織（莖和根）和土壤樣本。

實驗結(jié)果

文章一：研究表明DNA提取方法會影響檢測試驗的可靠性，但是ddPCR受到的影響更小。較低的細(xì)菌濃度下，由于Ct之間的差異較大（特別是在qPCR反應(yīng)）并且由于技術(shù)重復(fù)之間有更大的可變性。但是數(shù)字PCR在檢測中更靈敏，且在低濃度樣本的檢測的結(jié)果是qpcr的10倍

文章二：盡管dPCR的動態(tài)范圍較低（3對數(shù)，qPCR為7對數(shù)），但該技術(shù)被證明在極低拷貝數(shù)下具有非常高的精度。dPCR能夠在較寬的濃度范圍內(nèi)準(zhǔn)確地檢測出所有類型樣品中的病原體。dPCR是一種非常精確的煙草桿菌鑒定技術(shù)，這種方法適用于土壤、莖和根的極低拷貝數(shù)。

拓展：dPCR的原理及對比

dPCR的原理是通過有限稀釋將含有目的DNA的PCR反應(yīng)體系分散成無數(shù)個單一模板的PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，再通過統(tǒng)計檢測結(jié)果及泊松分布校正實現(xiàn)目的DNA的絕對定量。

    dPCR包括三個步驟：分散體系、PCR擴(kuò)增和信號檢測。通過樣品的稀釋和分散形成分散體系，這一步是限制dPCR發(fā)展應(yīng)用的一個重要因素，其所引起的分散數(shù)量和分散體積的不同極大地影響著定量結(jié)果的精度與準(zhǔn)確性。分散體系的形成增加了靶分子的有效濃度，并在一定程度上對存在干擾的復(fù)雜化合物進(jìn)行了純化，提高了靶分子和背景之間的比率。基于dPCR統(tǒng)計的定量方式，反應(yīng)體系的分散數(shù)量越多，低濃度靶分子的檢測可能性就越大，檢測靈敏度就越高，同時多個單一的反應(yīng)單元也為多目標(biāo)序列的高通量檢測的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。分散體積的不同會對拷貝數(shù)結(jié)果的測量產(chǎn)生影響，是造成dPCR精度下降的一個潛在因素，且與檢測限的大小形成反比關(guān)系。

    dPCR系統(tǒng)根據(jù)分散方式的不同可分為三種主要類型：基于油包水微滴生成技術(shù)的微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)、基于微孔芯片的微孔板數(shù)字PCR (micro-chamber digital PCR, mdPCR)和基于微流控技術(shù)的微流控芯片式數(shù)字PCR (microfluidic chip digital PCR, mcdPCR)。

   另外，基于水凝膠珠、瓊脂糖珠和生物打印技術(shù)等樣本分散方式的dPCR雖然尚未商業(yè)化，但在現(xiàn)有的實驗研究中己取得一定進(jìn)展。微滴式通過油包裹PCR體系形成無數(shù)個油包水微滴，每個微滴是一個獨(dú)立的反應(yīng)單元，這種特殊的微滴在進(jìn)行PCR時能夠保證完整的形態(tài)，不會互相擴(kuò)散，也阻止PCR混合物液滴在熱擴(kuò)增過程的蒸發(fā)；微孔芯片式是利用光刻技術(shù)在硅基上刻蝕出微孔陣列，再通過表面改性、打磨等操作形成數(shù)萬個納升級的表面疏水和孔內(nèi)壁親水的微反應(yīng)室；微流控芯片式則是利用微流控芯片裝置使PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)確快速地分散于芯片孔中，而每個孔都是一個小反應(yīng)體系(納升級)。

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