來源：本站 作者：zhangyang 時間：2025/2/26

        在當(dāng)今環(huán)境科學(xué)研究中，數(shù)字PCR（dPCR）作為一種高靈敏度、高特異性的分子檢測技術(shù)，正逐漸成為監(jiān)測水體污染的重要工具。隨著全球水資源短缺和水污染問題的日益嚴(yán)重，傳統(tǒng)的水質(zhì)檢測方法已難以滿足快速、準(zhǔn)確的需求。數(shù)字PCR通過對目標(biāo)DNA分子的精確計數(shù)，不僅能夠有效識別水體中的微生物和污染物，還能為生態(tài)保護和水資源管理提供科學(xué)依據(jù)。本文將探討數(shù)字PCR在環(huán)境水體研究中的應(yīng)用前景及其帶來的變革。

一、數(shù)字PCR的原理

         數(shù)字PCR（dPCR）是一種基于PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)的定量分析方法，其原理是將待擴增的DNA樣本分配到大量微小反應(yīng)室中，每個反應(yīng)室中可能含有零個或一個目標(biāo)DNA分子。通過進(jìn)行PCR擴增，只有含有目標(biāo)DNA的反應(yīng)室會產(chǎn)生熒光信號。最終，通過統(tǒng)計陽性反應(yīng)室的數(shù)量，利用泊松分布公式，可以精確計算出樣本中目標(biāo)DNA的絕對拷貝數(shù)。

        這種方法具有高靈敏度和高特異性，能夠有效克服傳統(tǒng)PCR在定量分析中的局限性。

二、數(shù)字PCR與水體研究

1、水產(chǎn)養(yǎng)殖

微生物在有機物去除和氮循環(huán)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，同時也可能產(chǎn)生有毒的硫化氫（H2S），如果它們對魚類有致病性或具備益生菌特性，可能會直接影響魚類健康。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于監(jiān)測某些細(xì)菌種類的數(shù)量的方法通常精度、特異性、靈敏度較低，并且耗時較長。

研究人員^[1]用ddPCR分析了與鮭魚生產(chǎn)相關(guān)的3類細(xì)菌，分別是魚類病原體、可從海產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到人身上的人類病原體，以及破環(huán)飼養(yǎng)環(huán)境威脅魚類健康的細(xì)菌。最后得出結(jié)論，數(shù)字PCR不僅能對極低含量的細(xì)菌gDNA進(jìn)行定量，而且在復(fù)雜樣品中依舊能保持如單個樣品一致的檢測精確性。

2、魚類種群豐度

測量水樣中環(huán)境DNA (eDNA)濃度有可能是一種既經(jīng)濟高效又無損的估計魚類種群豐度的方法。然而，水生系統(tǒng)中固有的非生物和生物條件的時空變異性被認(rèn)為是確定魚類eDNA濃度與魚類種群豐度之間關(guān)系的主要障礙。

研究人員^[2]將ddPCR方法獲得的魚類eDNA (COI線粒體區(qū)域，134 bp)濃度與魚類種群豐度(即個體數(shù)量)和生物量的高精度估計進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，在第三次采樣時間（ST3），刺魚eDNA濃度與個體豐度（即魚類數(shù)量）和生物量之間發(fā)現(xiàn)了正相關(guān)關(guān)系（見圖2）。同樣，在第四次采樣時間（ST4），刺魚eDNA濃度和豐度及生物量之間也發(fā)現(xiàn)了正相關(guān)關(guān)系（見圖）。

        結(jié)論：研究強調(diào)了基于ddPCR的eDNA是未來自然系統(tǒng)中魚類種群豐度量化的一種有前途的方法。

對海洋中鯨、海豚和鼠海豚的物種、亞種或種群進(jìn)行基因取樣鑒定仍然具有挑戰(zhàn)性。大多數(shù)樣本都是通過某種形式的活組織檢查收集的，當(dāng)個體在表面時需要近距離接近血管。另一群科研人員[3]采用數(shù)字PCR技術(shù)，利用從海水中采集的環(huán)境DNA進(jìn)行鯨類動物的檢測和物種鑒定。結(jié)果證實了在鯨魚身后長達(dá)2小時內(nèi)檢測到eDNA的潛力。

海洋中采樣外置和數(shù)字PCR檢測結(jié)果

3、魚類的定性與定量

（1）定性——真假鑒別

高價值銀鯧魚(Pampus argenteus)的摻假是世界范圍內(nèi)一個嚴(yán)重的問題，需要對該物種進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定和定量。

研究人員^[4]通過建立一種ddPCR方法，檢測銀鯧魚。結(jié)果表明ddPCR的絕對檢測限和定量限分別為 2 copies/μl和 21 copies/μl。對肉類混合物的靈敏度為0.1%，對DNA混合物的靈敏度為0.5%。ddPCR的敏感性是real-time PCR的156倍。

本研究中建立的ddPCR方法可以成為解決物種摻假問題的有價值的工具。

同樣，大西洋三文魚因其獨特的口感和豐富的營養(yǎng)價值而受到全球消費者的青睞。然而，由于市場需求巨大，價格較高的大西洋三文魚常常被價格較低的虹鱒魚摻假或替代，這不僅損害了消費者的利益，也帶來了潛在的健康風(fēng)險。

傳統(tǒng)的檢測方法，如形態(tài)學(xué)特征識別、光譜和色譜技術(shù)，雖然在一定程度上能夠識別魚類品種，但存在特異性和靈敏度不足的問題。而基于DNA的檢測方法，尤其是實時定量PCR（qPCR），雖然在定性和定量檢測中表現(xiàn)出色，但仍受限于擴增效率和DNA模板純度的影響。研究者^[5]建立了一種基于液滴數(shù)字PCR (ddPCR)檢測的大西洋三文魚與虹鱒魚摻假的精確鑒別和定量方法。與實時定量PCR (qPCR)檢測相比，所建立的ddPCR方法具有更高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性?？傮w而言，基于ddpcr的定量方法具有較高的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、靈敏度和實用性，適合用于鮭魚產(chǎn)品的常規(guī)監(jiān)測和質(zhì)量保證。

（2）定量

鱈魚的需求量上升，品種鑒定和含量估算對食品的真實性和質(zhì)量評價具有重要意義。

研究者采用液滴數(shù)字PCR技術(shù)，建立了阿拉斯加鱈魚在海產(chǎn)品中的含量測定方法。利用該方法，發(fā)現(xiàn)原始樣品質(zhì)量、DNA濃度和DNA拷貝數(shù)之間存在線性關(guān)系。還建立了一個公式來計算原始樣品的重量，基于DNA拷貝的數(shù)量。

本研究結(jié)果表明，所描述的ddPCR方法適用于海鮮產(chǎn)品中阿拉斯加鱈魚的定量，并具有應(yīng)用于食品質(zhì)量認(rèn)證的各種任務(wù)的潛力。

4、水中病原體-水質(zhì)監(jiān)測

軍團菌引發(fā)的疾病在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，這使得監(jiān)測飲用水中的軍團菌成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一項重要任務(wù)。然而，現(xiàn)有的監(jiān)測策略主要依賴于基于培養(yǎng)的方法，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法耗時長、精度低，而基于PCR的方法雖然快速，但可能同時檢測到活細(xì)胞和死細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。

研究者^[6]使用了兩種常見的商業(yè)DNA提取試劑盒（方法A和方法B），對來自家庭淋浴器的水樣和生物膜樣品進(jìn)行了處理。

結(jié)果顯示，數(shù)字PCR技術(shù)（ddPCR）以其高靈敏度、精確度和無需標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)勢，為病原菌的監(jiān)測提供了新的解決方案。

 相關(guān)文獻(xiàn)表明^[7]，dPCR越來越多地用于測定糞便指示菌、微生物源跟蹤標(biāo)記基因和各種水生環(huán)境中的病原體。

優(yōu)化的dPCR分析方法可以定量微生物的遺傳物質(zhì)，而不需要校準(zhǔn)曲線，并且通常具有比定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)更好的分析性能(即更高的靈敏度、精度和可重復(fù)性)。

5、藻類

奧得河發(fā)生一起由單細(xì)胞藻類土棲藻引起的有害藻華事件，導(dǎo)致了大規(guī)模魚類及其他生物的死亡。這種藻類能產(chǎn)生名為prymnesins的毒素，對水生生物具有極高的毒性。研究團隊通過一系列先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，對這一生態(tài)災(zāi)難進(jìn)行了深入分析。

研究人員[8]從奧得河的兩個監(jiān)測站點收集了水樣，并利用ddPCR技術(shù)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，樣本中檢測到的P. parvum ITS2拷貝數(shù)最高，達(dá)到了約1.14×10⁹拷貝/升。這一結(jié)果與顯微鏡計數(shù)的細(xì)胞密度相吻合，證實了ddPCR技術(shù)在環(huán)境樣本中的有效性。

結(jié)論：本文建立的微滴數(shù)字PCR試驗將有助于未來監(jiān)測奧得河或任何其他受鹽影響和微咸水體中低水平的細(xì)小瘧原蟲。

參考文獻(xiàn)

[1] Netzer L D T .Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR[J].Journal of Microbiological Methods, 2021, 183(1).

[2] Capo, Eric, et al. "Droplet digital PCR applied to environmental DNA, a promising method to estimate fish population abundance from humic‐rich aquatic ecosystems." Environmental DNA 3.2 (2021): 343-352.

[3] Baker, C. Scott, et al. "Environmental DNA (eDNA) from the wake of the whales: Droplet digital PCR for detection and species identification." Frontiers in Marine Science 5 (2018): 133.

[4] Cao, Weiwei, et al. "Species identification and quantification of silver pomfret using the droplet digital PCR assay." Food chemistry 302 (2020): 125331.

[5] Ma, X. Y., Shao, Z. L., Yu, X. P., & Wang, Z. L. (2023). A Droplet Digital PCR-Based Approach for Quantitative Analysis of the Adulteration of Atlantic Salmon with Rainbow Trout. Foods, 12(23), 4309.

[6] Cavallaro, Alessio, et al. "The impact of DNA extraction on the quantification of Legionella, with implications for ecological studies." Microbiology Spectrum 12.8 (2024): e00713-24.

[7] Tiwari, Ananda, et al. "Application of digital PCR for public health-related water quality monitoring." Science of the Total Environment 837 (2022): 155663.

[8] Mora, Demetrio, et al. "From genes to toxins: Profiling Prymnesium parvum during a riverine harmful algal bloom." Harmful Algae 136 (2024): 102644.

臻準(zhǔn)數(shù)字芯片式PCR

1.微腔式（反應(yīng)單元物理分割）

2.儀器系統(tǒng)多款選擇

3.產(chǎn)品優(yōu)勢

①10x的buffer,上樣量可以控制到2-17μL，對于低濃度和高濃度樣本都可以適用。

②樣本利用率高，可以達(dá)到95%。漏檢的可能性小，其他品牌有可能是60%左右，低濃度時有可能漏檢。

③可以用染料法SYBR Green I，其他品牌染料法做的比較差，只能用EvaGreen

④儀器小巧、通量靈活、價格便宜

⑤儀器操作簡單、受人為因素影響小。其他家操作注意事項多。

⑥固相分割法比油包水方式穩(wěn)定，從qPCR轉(zhuǎn)移過來更容易。

⑦芯片的價格低，供貨快。

⑧芯片的孔大小均一，不會破裂。

⑨可協(xié)助相關(guān)試劑盒的開發(fā)

相關(guān)產(chǎn)品鏈接：http://www.okinawanorthglenn.com/Products/443.html